PFKFB4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410933-ACT

La PFKFB4 umana codifica la 6-fosfofrutto-2-chinasi/fruttosio-2,6-bisfosfatasi 4, un enzima bifunzionale che controlla i livelli cellulari di fruttosio-2,6-bisfosfato e, di conseguenza, modula il flusso glicolitico attraverso la regolazione allosterica di PFK1. Modulando il flusso di carbonio tra la glicolisi e le relative vie metaboliche a valle, PFKFB4 contribuisce all’adattamento metabolico in condizioni di stress quali ipossia e limitazione di nutrienti, con effetti successivi sull’equilibrio redox e sulla capacità biosintetica. Alterazioni dell’espressione e dell’attività di PFKFB4 sono state associate alla riprogrammazione metabolica osservata in diversi contesti rilevanti per la malattia, in particolare in modelli di segnalazione proliferativa e di stress del microambiente. Di conseguenza, PFKFB4 è spesso studiata in vie che collegano la glicolisi, le risposte regolate da HIF e il controllo della crescita.

PFKFB4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PFKFB4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PFKFB4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PFKFB4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PFKFB4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PFKFB4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PFKFB4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PFKFB4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PFKFB4 nelle cellule tumorali con espressione di PFKFB4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.