Plásmido CRISPR de Activación (h) PEPCK-C/PCK1: sc-401295-ACT

El PCK1 humano codifica la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa citosólica (PEPCK-C), una enzima limitante de la velocidad en la gluconeogénesis que cataliza la conversión de oxaloacetato en fosfoenolpiruvato utilizando GTP. La PEPCK-C integra la producción hepática y renal de glucosa con el metabolismo central del carbono, conectando los intermediarios del ciclo del TCA con los flujos glucolíticos y anapleróticos. Su expresión está estrictamente regulada por señales hormonales y nutricionales a través de redes transcripcionales que incluyen la señalización cAMP/PKA, las vías de respuesta a glucocorticoides y la represión dependiente de insulina. La actividad desregulada de PCK1 y su control transcripcional se estudian ampliamente en contextos de enfermedades metabólicas, como la resistencia a la insulina, la biología del hígado graso y la reprogramación metabólica tumoral.

PEPCK-C/PCK1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PCK1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PEPCK-C/PCK1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PCK1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PCK1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PEPCK-C/PCK1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PCK1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PEPCK-C/PCK1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PEPCK-C/PCK1 en células tumorales con expresión de PCK1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.