Plasmide CRISPR d'Activation (h) PCMT1: sc-418153-ACT

La protéine O‑méthyltransférase 1 des L‑isoaspartates (D‑aspartates) (PCMT1) est une méthyltransférase de réparation des protéines conservée, qui reconnaît les résidus isoaspartyl issus d’une désamidation ou d’une isomérisation spontanée et catalyse leur méthylation afin de faciliter le repliement et le renouvellement des protéines. En limitant l’accumulation de protéines endommagées, PCMT1 soutient les réseaux de protéostasie, en interaction avec les réponses cellulaires au stress, le contrôle de la qualité des protéines associé au vieillissement et la régulation de la stabilité protéique. L’activité de PCMT1 a été associée à l’homéostasie neuronale et métabolique, où une capacité de réparation altérée peut favoriser l’accumulation de protéines dysfonctionnelles et accroître la vulnérabilité cellulaire en conditions de stress. La dérégulation des voies de réparation des protéines impliquant PCMT1 est donc pertinente pour l’étude de la neurodégénérescence, de la biologie du stress oxydatif et, plus largement, des mécanismes de dommages protéiques dans les cellules humaines.

PCMT1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PCMT1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PCMT1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PCMT1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PCMT1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PCMT1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PCMT1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PCMT1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PCMT1 dans les cellules tumorales présentant une expression de PCMT1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.