PASK CRISPR Activation Plasmid (h): sc-416953-ACT

Die Per-Arnt-Sim-(PAS)-Domäne enthaltende Serin/Threonin-Proteinkinase (PASK) fungiert als Nährstoff- und Energiesensor-Kinase, die metabolische Signale mit Genexpression und Entscheidungen über das Zellschicksal verknüpft. In menschlichen Zellen integriert PASK Signale zur Glukoseverfügbarkeit und zur mitochondrialen Funktion und moduliert nachgeschaltete Transkriptionsprogramme, die am Kohlenhydrat- und Lipidstoffwechsel beteiligt sind, einschließlich Signalwege, die mit der endokrinen Differenzierung des Pankreas und insulinresponsiven Prozessen zusammenhängen. Die PASK-Aktivität wurde im Kontext von AMPK- und mTOR-nahen Signalnetzwerken untersucht, in denen sie das Gleichgewicht zwischen anabolen und katabolen Prozessen sowie stressadaptive Antworten beeinflussen kann. Eine fehlregulierte PASK-Expression oder -Signalübertragung wurde mit metabolischen Phänotypen in Verbindung gebracht, die für die Diabetes- und Adipositasforschung relevant sind, und zudem im Hinblick auf breitere Rollen bei Proliferation und zellulärer Anpassung untersucht.

PASK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PASK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PASK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PASK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PASK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PASK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PASK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PASK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PASK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PASK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.