PASK Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-416953-ACT

A quinase serina/treonina contendo domínio Per-Arnt-Sim (PAS), PASK, atua como uma quinase sensora de nutrientes e energia que conecta sinais metabólicos à expressão gênica e a decisões de destino celular. Em células humanas, a PASK integra sinais relacionados à disponibilidade de glicose e à função mitocondrial e modula programas transcricionais a jusante envolvidos no metabolismo de carboidratos e lipídios, incluindo vias ligadas à diferenciação endócrina pancreática e a processos responsivos à insulina. A atividade da PASK tem sido estudada no contexto de redes de sinalização relacionadas a AMPK e mTOR, nas quais pode influenciar o equilíbrio anabólico–catabólico e respostas adaptativas ao estresse. A expressão ou sinalização desregulada de PASK tem sido associada a fenótipos metabólicos relevantes para pesquisas sobre diabetes e obesidade, e também tem sido explorada por seus papéis mais amplos em proliferação e adaptação celular.

PASK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PASK sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PASK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PASK em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PASK, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PASK. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PASK nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PASK no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PASK em células tumorais com expressão de PASK silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.