PARG CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404382-ACT

Poly(ADP-Ribose)-Glykohydrolase (PARG) ist das wichtigste Enzym, das für die Hydrolyse der von Mitgliedern der PARP-Familie synthetisierten Poly(ADP-Ribose)- (PAR-)Ketten verantwortlich ist. Dadurch beendet es die PARylierungs-Signalgebung und stellt nach Stressantworten die Proteinfunktion wieder her. Durch die Regulation des PAR-Umsatzes trägt PARG zur Kontrolle von DNA-Schadensdetektion und -reparatur, Chromatin-Remodelling, Toleranz gegenüber Replikationsstress sowie Zelltodwegen wie Parthanatos bei, indem es die PAR-abhängige Rekrutierung von Proteinen moduliert. Die PARG-Aktivität ist mit Prozessen der Basenexzisionsreparatur und der Reparatur von Einzelstrangbrüchen verknüpft, beeinflusst dadurch die Genomstabilität und transkriptionelle Programme, die mit der zellulären Stressanpassung zusammenhängen. Eine fehlregulierte PAR-Metabolisierung wird mit Krebsbiologie und Neurodegeneration in Verbindung gebracht, was PARG zu einem geeigneten Knotenpunkt für mechanistische Studien zur DNA-Reparaturkapazität, Chromatindynamik und stressinduzierter Signalgebung macht.

PARG Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PARG-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PARG Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PARG-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PARG-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PARG-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PARG-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PARG-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PARG-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PARG-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.