Plasmide CRISPR d'Activation (h) Nogo: sc-400819-ACT

RTN4 code pour Nogo (également appelé réticulon-4), une protéine associée au réticulum endoplasmique et à la myéline qui module la croissance des neurites, la régénération axonale et la plasticité synaptique. Les isoformes de Nogo transmettent des signaux via des récepteurs tels que NgR1 et des corécepteurs, influençant le remodelage du cytosquelette dépendant de RhoA/ROCK, l’effondrement du cône de croissance et les interactions neurone–glie. Dans le SNC, Nogo contribue au raffinement des circuits dépendant de l’activité et limite le remodelage structurel après lésion, reliant la régulation de RTN4 aux voies qui gouvernent la connectivité neuronale. Des altérations de la signalisation et de l’expression de Nogo ont été étudiées dans des contextes incluant les traumatismes neurologiques, la neurodégénérescence et des phénotypes neuropsychiatriques où la repousse axonale et la stabilité des réseaux sont perturbées.

Nogo Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RTN4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Nogo Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RTN4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RTN4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Nogo. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RTN4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Nogo au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Nogo dans les cellules tumorales présentant une expression de RTN4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.