mtTFA Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401208-ACT

TFAM codifica o fator de transcrição mitocondrial A (mtTFA), uma proteína de ligação ao DNA do tipo high-mobility group que empacota o DNA mitocondrial (mtDNA) em nucleoides e coordena a replicação e a transcrição do mtDNA. O mtTFA é central para a biogênese mitocondrial, para a capacidade de fosforilação oxidativa e para a manutenção da integridade do genoma mitocondrial, por meio da regulação do número de cópias de mtDNA e da acessibilidade dos promotores. A perturbação da expressão de TFAM está associada a alterações na respiração, aumento da sinalização de estresse mitocondrial e ampla reprogramação metabólica, tornando-o relevante para estudos de neurodegeneração, disfunção cardiometabólica e remodelamento mitocondrial associado ao câncer. Como um nó-chave na comunicação mitocôndria-núcleo, TFAM é frequentemente utilizado para investigar sinalização retrógrada, homeostase de espécies reativas de oxigênio e suscetibilidade à apoptose.

mtTFA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TFAM sem alterar a sequência de ADN subjacente.

mtTFA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TFAM em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TFAM, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de mtTFA. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TFAM nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de mtTFA no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via mtTFA em células tumorais com expressão de TFAM silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.