MIA2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418205-ACT

MIA2 umano (melanoma inhibitory activity member 2) codifica una grande proteina secreta/associata al reticolo endoplasmatico (RE), implicata nel traffico proteico e in processi legati alla matrice extracellulare, con rilevanti connessioni funzionali alla biologia delle cellule epatiche. MIA2 partecipa all’omeostasi della via secretoria ed è stata associata alla regolazione della differenziazione cellulare, delle risposte allo stress e di programmi di rimodellamento tissutale che si intersecano con la segnalazione infiammatoria e fibrotica. Un’espressione alterata di MIA2 è stata riportata in diverse patologie a carico del fegato e in fenotipi rilevanti per la malignità, a supporto del suo impiego come strumento molecolare per studiare le interazioni nel microambiente tumorale e la dinamica del proteoma secretorio. Di conseguenza, MIA2 è di interesse per studi meccanicistici su vie dipendenti dalla secrezione, segnalazione extracellulare e regolazione trascrizionale associata a malattia.

MIA2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MIA2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MIA2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MIA2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MIA2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MIA2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MIA2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MIA2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MIA2 nelle cellule tumorali con espressione di MIA2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.