MetRS Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402763-ACT

Il gene umano **MARS** codifica la metionil‑tRNA sintetasi (MetRS), una aminoacil‑tRNA sintetasi di classe I che lega la metionina ai tRNA^Met iniziatore ed elongatore, instaurando l’avvio della traduzione e sostenendo la sintesi proteica globale. L’attività di MetRS collega la disponibilità di aminoacidi alla produttività dei ribosomi e alla proteostasi, influenzando risposte allo stress quali la risposta integrata allo stress e la segnalazione nutrizionale associata a mTOR attraverso il suo impatto sulla capacità traduttiva. In quanto componente chiave della macchina di traduzione citosolica, alterazioni dell’espressione o della funzione di MARS possono perturbare i programmi di crescita cellulare, l’omeostasi mitocondriale e del reticolo endoplasmatico tramite squilibri del proteoma, e le risposte adattative alla limitazione di aminoacidi. La disregolazione di fattori legati alla traduzione, incluse le aminoacil‑tRNA sintetasi, è frequentemente studiata nel contesto di fenotipi neuroevolutivi, della fitness delle cellule tumorali e della segnalazione infiammatoria, in cui il controllo della traduzione modella lo stato cellulare.

MetRS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MARS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MetRS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MARS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MARS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MetRS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MARS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MetRS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MetRS nelle cellule tumorali con espressione di MARS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.