Metallothionein 4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-413667-ACT

MT4 codifica la metallotioneina 4, una proteina ricca di cisteina in grado di legare metalli, che contribuisce al buffering cellulare di zinco e rame e alla protezione dalla tossicità dei metalli pesanti tramite sequestro basato su gruppi tiolici. Come parte della famiglia delle metallotioneine, la Metallotioneina 4 supporta l’omeostasi redox limitando lo stress ossidativo catalizzato dai metalli e può influenzare programmi trascrizionali sensibili ai metalli, incluse le vie regolate da MTF1. L’espressione di MT4 è arricchita in contesti epiteliali stratificati, dove la disponibilità di metalli e l’equilibrio ossidativo modellano la differenziazione e l’integrità della barriera. Alterazioni della segnalazione delle metallotioneine e disomeostasi dei metalli sono spesso oggetto di studio nelle risposte allo stress epiteliale, nel rimodellamento tissutale associato all’infiammazione e nella tossicologia correlata ai metalli.

Metallothionein 4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MT4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Metallothionein 4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MT4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MT4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Metallothionein 4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MT4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Metallothionein 4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Metallothionein 4 nelle cellule tumorali con espressione di MT4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.