Metallothionein 1A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-410887-ACT

MT1A codifica a metalotioneína 1A, uma proteína rica em cisteína e ligadora de metais que atua como tampão do zinco e do cobre intracelulares e sequestra metais pesados tóxicos, como cádmio e mercúrio. Ao regular a homeostase de metais e o equilíbrio redox celular, a MT1A influencia as respostas ao estresse oxidativo, os programas de desintoxicação e vias de sinalização que dependem da disponibilidade de zinco, incluindo a atividade de fatores de transcrição e redes de genes induzíveis por estresse. A expressão de MT1A responde à exposição a metais, a sinais inflamatórios e ao estresse celular, e alterações na regulação de metalotioneínas têm sido associadas à suscetibilidade à toxicidade por metais, à lesão tecidual e a uma patofisiologia mais ampla ligada ao dano oxidativo. Essas propriedades tornam MT1A um ponto de interesse útil para estudar proteostase dependente de metais, adaptação ao estresse e interações entre desintoxicação e sinalização inflamatória.

Metallothionein 1A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MT1A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Metallothionein 1A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MT1A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MT1A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Metallothionein 1A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MT1A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Metallothionein 1A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Metallothionein 1A em células tumorais com expressão de MT1A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.