Plásmido CRISPR de Activación (h) megalin/LRP2: sc-401094-ACT

LRP2 codifica megalina, un receptor endocítico multiligando de la familia de receptores de LDL que se expresa en altos niveles en epitelios absortivos y media la internalización dependiente de clatrina de diversos ligandos proteicos, vitaminas y complejos hormona–transportador. Megalina/LRP2 coordina la captación mediada por receptor y el tráfico hacia endosomas y lisosomas, contribuyendo a la polaridad epitelial, la homeostasis de nutrientes y la depuración de proteínas extracelulares; además, se interrelaciona funcionalmente con vías que implican a cubilina/AMN, el manejo de albúmina y de la proteína de unión a la vitamina D, y ligandos asociados a lipoproteínas. En el sistema nervioso y otros tejidos, LRP2 se ha vinculado a la regulación de la señalización de morfógenos, incluida la modulación de la disponibilidad de Sonic hedgehog y BMP durante el desarrollo. La alteración genética o funcional de LRP2 se asocia con fenotipos sindrómicos del desarrollo y defectos en la reabsorción tubular renal de proteínas, lo que la hace relevante para estudios de transporte epitelial, señalización del desarrollo y tráfico de receptores.

megalin/LRP2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de LRP2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

megalin/LRP2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus LRP2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional LRP2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de megalin/LRP2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo LRP2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de megalin/LRP2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía megalin/LRP2 en células tumorales con expresión de LRP2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.