MAD2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401027-ACT

Human MAD2L1 kodiert MAD2, eine zentrale Komponente des Spindelkontrollpunkts, der die Anheftung von Kinetochor und Mikrotubuli überwacht und den Beginn der Anaphase verzögert, bis die Chromosomen eine bipolare Ausrichtung erreicht haben. MAD2 ist an der Bildung des mitotischen Checkpoint-Komplexes beteiligt, der die APC/C‑CDC20‑Aktivität hemmt und dadurch die Stabilität von Cyclin B und Securin, die Chromosomensegregation sowie die Aufrechterhaltung der genomischen Integrität koordiniert. Eine Fehlregulation der MAD2L1-Expression oder der Checkpoint-Signalgebung kann chromosomale Instabilität und Aneuploidie fördern – Merkmale, die in der Biologie proliferativer Erkrankungen häufig beobachtet werden. Daher wird MAD2L1 umfassend in Signalwegen untersucht, die den Zellzyklusfortschritt, das Timing der Mitose und die Überwachung des Genoms steuern.

MAD2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MAD2L1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MAD2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MAD2L1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MAD2L1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MAD2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MAD2L1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MAD2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MAD2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MAD2L1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.