leupaxin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405101-ACT

LPXN codifica la leupaxin, una proteina adattatrice della famiglia della paxillina arricchita nelle adesioni focali, dove coordina la segnalazione dipendente dalle integrine con il rimodellamento del citoscheletro di actina. Attraverso interazioni con chinasi e proteine scaffold, la leupaxin contribuisce ai processi di adesione cellulare, migrazione e meccanotrasduzione che modellano la percezione della matrice extracellulare e i programmi trascrizionali a valle. L’attività di LPXN interseca le vie delle adesioni focali e quelle collegate alle Rho GTPasi che regolano la motilità cellulare e il comportamento invasivo. Un’espressione o una segnalazione deregolate che coinvolgono la leupaxin sono state riportate in molteplici contesti tumorali e in diversi stati funzionali delle cellule immunitarie, a supporto del suo impiego come nodo meccanicistico negli studi su fenotipi associati alla metastasi e sulla segnalazione guidata dall’adesione.

leupaxin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LPXN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

leupaxin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LPXN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LPXN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di leupaxin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LPXN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da leupaxin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via leupaxin nelle cellule tumorali con espressione di LPXN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.