Plásmido CRISPR de Activación (m) LAR: sc-422521-ACT

El gen murino *Ptprf* codifica la fosfatasa de tirosina proteica tipo receptor LAR (PTPRF), un regulador de señalización transmembrana que equilibra vías dependientes de la fosforilación que controlan la adhesión celular, la migración y el crecimiento de neuritas. LAR modula las adhesiones focales y la dinámica del citoesqueleto mediante interacciones con señales de la matriz extracelular y andamiajes intracelulares, influyendo en la señalización ligada a integrinas y en las salidas de los receptores de factores de crecimiento. En tejidos neuronales y metabólicos, PTPRF/LAR se ha relacionado con la organización de sinapsis, la guía axonal y la regulación de la señalización del receptor de insulina, lo que lo hace relevante para estudios de fenotipos del neurodesarrollo y mecanismos de sensibilidad a la insulina. La actividad de la fosfatasa desregulada y la señalización de adhesión alterada también se han implicado en procesos oncogénicos como la proliferación e invasión aberrantes, lo que respalda su uso como un nodo para la interrogación de vías.

LAR El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Ptprf sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

LAR El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Ptprf en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Ptprf, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de LAR. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Ptprf y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de LAR en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía LAR en células tumorales con expresión de Ptprf silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.