KV4.2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402801-ACT

KCND2 codifica a subunidade do canal de potássio dependente de voltagem KV4.2, um dos principais mediadores das correntes rápidas e transitórias de K+ do tipo A em neurónios e cardiomiócitos. Ao moldar a repolarização do potencial de ação, a adaptação da frequência de disparo e os sinais retropropagados, o KV4.2 influencia a excitabilidade, a integração sináptica e a plasticidade dependente da atividade, sendo regulado por fosforilação e por subunidades auxiliares como KChIPs e DPP6/10. Alterações associadas ao KCND2 na expressão ou no gating do canal têm sido relacionadas com fenótipos neurológicos, incluindo epilepsia e perturbações do neurodesenvolvimento, e a dinâmica de repolarização dependente de KV4.2 é relevante para estudos sobre suscetibilidade a arritmias e eletrofisiologia cardíaca. Estas propriedades tornam o KCND2 um alvo útil para investigar a biologia de canais iónicos, circuitos de excitabilidade e vias de sinalização que ajustam a condutância da membrana.

KV4.2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KCND2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

KV4.2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KCND2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KCND2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de KV4.2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KCND2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de KV4.2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via KV4.2 em células tumorais com expressão de KCND2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.