KIR3.1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404965-ACT

KCNJ3 codifica la subunità umana del canale del potassio a rettificazione entrante KIR3.1 (GIRK1), un componente centrale dei canali Kir (GIRK) attivati da proteine G, che collegano la segnalazione dei GPCR all’iperpolarizzazione della membrana. Formando canali eterotetramerici con altre subunità GIRK, KIR3.1 contribuisce a regolare l’eccitabilità neuronale, l’attività pacemaker e la neurotrasmissione inibitoria attraverso il controllo della conduttanza del potassio. Questo asse di canale ionico si integra con la segnalazione dipendente da cAMP/PKA e con la regolazione a valle del calcio, modellando i pattern di scarica e la responsività sinaptica. Un’alterata espressione di KCNJ3 o l’attività dei canali GIRK è stata associata a fenotipi legati all’elettrofisiologia ed è spesso oggetto di studio nel contesto della regolazione neurologica e del ritmo cardiaco, nonché in modelli cellulari di eccitabilità e trasduzione del segnale.

KIR3.1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KCNJ3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KIR3.1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KCNJ3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KCNJ3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KIR3.1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KCNJ3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KIR3.1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KIR3.1 nelle cellule tumorali con espressione di KCNJ3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.