ITI-H4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403358-ACT

ITIH4 kodiert die schwere Kette 4 des Inter-α-Trypsin-Inhibitors (ITI‑H4), ein sezerniertes, leberangereichertes Glykoprotein, das im Plasma zirkuliert und an der Biologie der extrazellulären Matrix sowie an proteasegesteuerten Entzündungsprozessen beteiligt ist. ITI‑H4 wird mit akute‑Phase‑assoziierter Proteolyse und dem Umbau hyaluronanreicher Matrizes in Verbindung gebracht, indem es über Interaktionen innerhalb des Netzwerks der Inter‑α‑Inhibitor‑Familie wirkt und so die Gewebehomöostase bei Verletzung und Entzündung beeinflusst. Eine veränderte ITIH4‑Expression oder ‑Prozessierung wurde in systemischen Entzündungszuständen und in mehreren krebsassoziierten proteomischen Signaturen beschrieben, was seine Eignung als mechanistischer Readout in krankheitsassoziierten Sekretomstudien unterstützt. In Zell‑ und Plasmamodellen stellt ITI‑H4 einen gut handhabbaren Ansatzpunkt dar, um zu untersuchen, wie hepatische Programme die extrazelluläre Signalübertragung, gerinnungsnahe Signalwege und den Immun‑Stroma‑Crosstalk prägen.

ITI-H4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ITIH4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ITI-H4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ITIH4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ITIH4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ITI-H4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ITIH4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ITI-H4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ITI-H4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ITIH4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.