HUNK Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405786-ACT

HUNK (hormonally upregulated neu-associated kinase) codifica una chinasi serina/treonina coinvolta in programmi di trasduzione del segnale che influenzano il comportamento delle cellule epiteliali, inclusi proliferazione, differenziamento e sopravvivenza. Le funzioni riportate collegano HUNK a vie responsivi ai fattori di crescita e a processi di adattamento allo stress che possono modulare, in modo dipendente dal contesto, la polarità cellulare e i fenotipi migratori. Un’espressione o un’attività alterata di HUNK è stata osservata in molteplici modelli correlati al cancro, a supporto della sua rilevanza per lo studio dei meccanismi della segnalazione oncogenica e della plasticità cellulare. In quanto regolatore legato all’attività chinasica, HUNK viene spesso studiato per capire come rimodelli le reti di fosforilazione a valle e gli output trascrizionali in sistemi cellulari umani.

HUNK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HUNK senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HUNK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HUNK nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HUNK, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HUNK. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HUNK nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HUNK nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HUNK nelle cellule tumorali con espressione di HUNK silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.