Herc2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420831-ACT

HERC2 del topo è una grande ligasi E3 dell’ubiquitina di tipo HECT che coordina la regolazione, dipendente dall’ubiquitina, della stabilità proteica e della segnalazione, integrando le risposte al danno al DNA con il controllo del ciclo cellulare. Partecipa ai processi di mantenimento del genoma, inclusa la gestione dello stress replicativo e il coordinamento delle vie di riparazione, attraverso la modulazione ubiquitino-mediata di substrati chiave. HERC2 è stata inoltre collegata alla funzione del centrosoma e alla proteostasi, mettendo in relazione la segnalazione dell’ubiquitina con la dinamica della cromatina e l’omeostasi cellulare. La deregolazione delle vie associate a HERC2 è rilevante per studi su fenotipi di instabilità genomica e sulla biologia dello sviluppo neurocognitivo in sistemi modello di mammifero.

Herc2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Herc2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Herc2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Herc2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Herc2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Herc2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Herc2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Herc2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Herc2 nelle cellule tumorali con espressione di Herc2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.