G_{α t1} Plasmide Double Nickase (h): sc-401559-NIC

GNAT1 codifica la subunità α della transducina specifica dei bastoncelli, Gαt1, una proteina G eterotrimerica che, durante la fototrasduzione, accoppia la rodopsina attivata alla fosfodiesterasi del cGMP (PDE6). In seguito alla stimolazione luminosa, Gαt1 scambia GDP con GTP e propaga un segnale che riduce i livelli di cGMP, modula l’attività dei canali regolati da nucleotidi ciclici e determina il potenziale di membrana del fotorecettore e l’output sinaptico. Questa cascata mediata da GPCR è strettamente regolata dall’idrolisi del GTP e dalla riassociazione con le subunità βγ, integrando l’amplificazione del segnale e le cinetiche di recupero nei bastoncelli retinici. La disregolazione della segnalazione dipendente da GNAT1 è stata associata a disfunzioni retiniche ereditarie, a supporto del suo impiego come bersaglio per studi meccanicistici della segnalazione visiva e della fisiologia dei fotorecettori.

Gα t1 Il plasmide Double Nickase (h) consiste in una coppia di plasmidi ingegnerizzati per l'editing ad alta specificità del locus GNAT1 nelle linee cellulari human. Ciascun plasmide esprime una nickasi Cas9 D10A e un sgRNA distinto che prende di mira filamenti di DNA opposti all'interno di GNAT1. Quando indirizzate verso siti adiacenti su filamenti di DNA opposti, le due nickasi generano tagli a filamento singolo sfalsati che insieme producono una rottura a doppio filamento sfalsata, richiedendo un'attività coordinata sul bersaglio da entrambe le guide. La rottura del DNA risultante viene risolta da vie di riparazione cellulare endogene, più comunemente attraverso la giunzione non omologa delle estremità (NHEJ), portando a inserzioni o delezioni che interrompono la funzione di GNAT1. Richiedendo il coinvolgimento di due sgRNA nel locus bersaglio, l'approccio a doppia nickasi migliora la specificità dell'editing e fornisce una strategia CRISPR complementare per applicazioni in cui è desiderato un controllo aggiuntivo sulla precisione del targeting.

Per supportare l'identificazione efficiente delle cellule modificate, un plasmide codifica la GFP per la visualizzazione fluorescente delle popolazioni trasfettate, mentre il plasmide di accompagnamento porta un gene di resistenza alla puromicina per la selezione antibiotica. Insieme, queste caratteristiche supportano l'arricchimento efficiente delle popolazioni co-trasfettate e semplificano la convalida dei cloni con GNAT1 interrotto.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.