Plasmide CRISPR d'Activation (h) G_{α i-3}: sc-400453-ACT

GNAI3 code la sous-unité humaine Gαi‑3 des protéines G hétérotrimériques, qui couple de nombreux GPCR à l’inhibition de l’adénylate cyclase, réduisant l’AMPc intracellulaire et modulant la signalisation en aval dépendante de la PKA. Via le cycle GPCR–protéine G, Gαi‑3 influence l’activité des canaux ioniques, la dynamique de la voie MAPK et la communication croisée avec la signalisation PI3K/AKT, façonnant des réponses telles que la chimiotaxie, la sécrétion et la prolifération. Des altérations de l’expression de GNAI3 ou un recâblage de l’axe GPCR–Gi ont été étudiés dans des contextes incluant la signalisation immunitaire, la fonction neuronale et des réseaux de signalisation associés au cancer, où l’homéostasie de l’AMPc et les programmes de migration sont perturbés.

Gα i-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GNAI3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Gα i-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GNAI3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GNAI3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Gα i-3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GNAI3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Gα i-3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Gα i-3 dans les cellules tumorales présentant une expression de GNAI3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.