GRK 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400558-ACT

GRK2 (nota anche come ADRBK1) codifica la G protein-coupled receptor kinase 2, una chinasi serina/treonina che fosforila i GPCR attivati per favorire il reclutamento di β-arrestina, la desensibilizzazione del recettore e il suo traffico intracellulare. Modulando durata e “bias” del segnale, GRK2 regola vie dei secondi messaggeri tra cui cAMP/PKA, la segnalazione fosfolipasi C–Ca²⁺ e le cascate MAPK/ERK, con effetti a valle sulla dinamica del citoscheletro e sulla segnalazione infiammatoria. GRK2 interagisce inoltre con substrati e proteine scaffold non GPCR, collegando gli input recettoriali alla migrazione cellulare, al metabolismo e alle risposte allo stress. Un’espressione o un’attività deregolata di GRK2 è stata associata in letteratura ad alterazioni della segnalazione cardiovascolare, a disfunzioni metaboliche e a vie correlate al cancro, supportandone l’impiego come nodo meccanicistico nella ricerca sulla segnalazione.

GRK 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GRK2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GRK 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GRK2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GRK2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GRK 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GRK2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GRK 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GRK 2 nelle cellule tumorali con espressione di GRK2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.