GP49B Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420634-ACT

Il gene murino Lilrb4a codifica GP49B, un recettore inibitorio della superfamiglia delle immunoglobuline espresso prevalentemente nelle cellule della linea mieloide, incluse mastociti e macrofagi. GP49B contiene motivi ITIM citoplasmatici che reclutano fosfatasi come SHP-1/2, attenuando le cascate di segnalazione accoppiate ai recettori Fc e alle integrine e limitando il flusso di calcio, la degranulazione, il rilascio di citochine e l’attivazione fagocitica. Attraverso la modulazione dei checkpoint dell’immunità innata, Lilrb4a influenza il tono infiammatorio, la presentazione dell’antigene e i programmi di rimodellamento tissutale nei compartimenti di barriera ed ematopoietico. Una segnalazione di GP49B deregolata è quindi rilevante per studi meccanicistici dell’omeostasi immunitaria, dell’infiammazione allergica e delle patologie guidate dai mieloidi nei modelli murini.

GP49B Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Lilrb4a senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GP49B Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Lilrb4a nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Lilrb4a, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GP49B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Lilrb4a nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GP49B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GP49B nelle cellule tumorali con espressione di Lilrb4a silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.