FKHR/FOXO1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400137-ACT

FOXO1 (FKHR) codifica um fator de transcrição da família forkhead box que integra sinais de insulina/IGF-1 e de fatores de crescimento para coordenar o controle do ciclo celular, a apoptose, as respostas ao estresse oxidativo e a homeostase metabólica. A atividade de FOXO1 é regulada por modificações pós-traducionais e pela localização subcelular a jusante da sinalização PI3K–AKT, com contribuições adicionais de AMPK e de vias ativadas por estresse. No núcleo, FOXO1 regula programas transcricionais envolvidos em gliconeogênese, autofagia e diferenciação, moldando decisões de destino celular dependentes do contexto. A desregulação da sinalização de FOXO1 está implicada na resistência à insulina e em doenças metabólicas, em alterações da função de células imunes e em processos oncogênicos, incluindo a fusão PAX3–FOXO1 observada no rabdomiossarcoma alveolar.

FKHR/FOXO1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FOXO1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FKHR/FOXO1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FOXO1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FOXO1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FKHR/FOXO1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FOXO1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FKHR/FOXO1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FKHR/FOXO1 em células tumorais com expressão de FOXO1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.