Plasmide CRISPR d'Activation (h) FAT4: sc-405268-ACT

Le gène humain **FAT4** code une cadhérine atypique qui se localise aux jonctions cellule–cellule et contribue à la polarité planaire des cellules, à la morphogenèse tissulaire et au contrôle de la croissance dépendant du contact. FAT4 agit au sein du réseau de signalisation **Hippo** en modulant l’activité des kinases centrales et les sorties transcriptionnelles en aval qui régulent la prolifération, l’apoptose et l’organisation épithéliale. Par ses rôles dans la coordination du cytosquelette et l’établissement de la polarité, FAT4 influence le patronage du développement et le maintien de l’architecture tissulaire. La dérégulation ou la perte de FAT4 a été associée à des programmes de polarité altérés et à des phénotypes pertinents pour la tumorigenèse, ce qui en fait une cible utile pour des études mécanistiques du contrôle de la croissance et de l’intégrité épithéliale.

FAT4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FAT4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FAT4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FAT4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FAT4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FAT4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FAT4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FAT4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FAT4 dans les cellules tumorales présentant une expression de FAT4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.