FANCC Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-416477-ACT

O FANCC humano codifica um componente central da via de reparo de DNA da anemia de Fanconi (AF), que coordena a resposta a ligações cruzadas intercadeias no DNA e a lesões associadas à replicação. O FANCC participa da formação e da função do complexo central da AF, favorecendo a monoubiquitinação de FANCD2/FANCI e o acionamento, a jusante, de mecanismos de recombinação homóloga e de estabilização da forquilha de replicação. Por meio dessas atividades, o FANCC contribui para a integridade do genoma, a coordenação de checkpoints do ciclo celular e a proteção contra estresse genotóxico endógeno e exógeno. A interrupção ou disfunção de FANCC está ligada à biologia da anemia de Fanconi e a fenótipos mais amplos de instabilidade genômica, relevantes para estudos de mecanismos de falência da medula óssea e de vulnerabilidades de reparo de DNA associadas ao câncer.

FANCC O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FANCC sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FANCC O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FANCC em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FANCC, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FANCC. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FANCC nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FANCC no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FANCC em células tumorais com expressão de FANCC silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.