Espin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403106-ACT

Humanes ESPN kodiert Espin, ein Aktin-bündelndes Protein, das die Assemblierung und Stabilität paralleler Aktinfilamentbündel in Mikrovilli und Stereozilien reguliert. Espin unterstützt die Morphogenese spezialisierter Zellfortsätze, die mechanosensorische Architektur und den Umbau des Zytoskeletts, indem es die Aktindynamik und membranassoziierte Gerüststrukturen koordiniert. Über seinen Einfluss auf die Organisation der Stereozilien ist ESPN mit der Funktion sensorischer Haarzellen verknüpft und wird in Signalwegen untersucht, die die Spezialisierung epithelialer Oberflächen und die Mechanotransduktion steuern. Eine Fehlregulation oder genetische Veränderung von ESPN wurde mit erblich bedingten Hörbeeinträchtigungen und damit verbundenen Defekten der Stereozilienstruktur in Verbindung gebracht, was ESPN für die Untersuchung zytoskelettaler Krankheitsmechanismen relevant macht.

Espin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ESPN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Espin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ESPN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ESPN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Espin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ESPN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Espin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Espin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ESPN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.