Plásmido CRISPR de Activación (h) ERCC1: sc-400630-ACT

ERCC1 codifica una endonucleasa específica de estructura que forma un heterodímero funcional con XPF (ERCC4) para llevar a cabo los pasos de incisión durante la reparación por escisión de nucleótidos (NER) y para resolver los entrecruzamientos interhebra del ADN en coordinación con la vía de la anemia de Fanconi. A través de estas actividades, ERCC1 ayuda a mantener la estabilidad del genoma, favorece la recuperación de la horquilla de replicación y limita la acumulación de lesiones en el ADN causadas por la luz ultravioleta y por agentes genotóxicos. La alteración de la función o de la expresión de ERCC1 se asocia con una capacidad de reparación del ADN disminuida, una mayor carga mutacional y una hipersensibilidad celular al estrés que daña el ADN. Por ello, los procesos de reparación dependientes de ERCC1 se estudian ampliamente en contextos como la carcinogénesis, el mantenimiento del genoma relacionado con el envejecimiento y los mecanismos de resistencia o susceptibilidad al daño del ADN en sistemas experimentales.

ERCC1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ERCC1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ERCC1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ERCC1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ERCC1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ERCC1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ERCC1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ERCC1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ERCC1 en células tumorales con expresión de ERCC1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.