ENX-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420259-ACT

O Ezh2 murino codifica a metiltransferase de lisina em histonas ENX-1, a subunidade catalítica do complexo repressivo Polycomb 2 (PRC2), que deposita H3K27me3 para manter programas de silenciamento transcricional. A ENX-1 regula a compactação da cromatina, a especificação de linhagens, a progressão do ciclo celular e a repressão de reguladores do desenvolvimento, integrando-se ao controle epigenético de enhancers e promotores ao longo dos estados de diferenciação. A atividade desregulada de EZH2/PRC2 é amplamente estudada na biologia do câncer, na manutenção de células-tronco e na diferenciação de células imunes, em que alterações na metilação de H3K27 podem reprogramar redes de expressão gênica. Assim, Ezh2 é um nó central para investigar o controle da proliferação, do comprometimento de destino e da plasticidade transcricional mediado pela cromatina em modelos murinos.

ENX-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Ezh2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ENX-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Ezh2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Ezh2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ENX-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Ezh2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ENX-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ENX-1 em células tumorais com expressão de Ezh2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.