Elk-1 Particelle di Attivazione Lentivirale (h2): sc-400385-LAC-2

Nell’uomo, ELK1 codifica il fattore di trascrizione della famiglia ETS Elk-1, un substrato nucleare di ERK1/2, JNK e della segnalazione MAPK p38, che viene fosforilato a valle di stimoli da fattori di crescita e da stress per attivare la trascrizione dei geni immediati precoci. Elk-1 si associa comunemente al serum response factor (SRF) sugli elementi di risposta al siero (SRE) per regolare programmi che controllano l’ingresso nel ciclo cellulare, la differenziazione, la trascrizione dipendente dall’attività neuronale e le risposte adattative ai segnali extracellulari. Un’attività deregolata di ELK1/Elk-1 è stata implicata nell’output oncogenico della via MAPK e in meccanismi rilevanti per la neurodegenerazione e la patologia vascolare attraverso reti trascrizionali alterate. L’editing genetico mirato di ELK1 consente l’analisi funzionale della trascrizione responsiva alle MAPK, la mappatura del legame di Elk-1 e delle dipendenze dai cofattori, nonché la costruzione di modelli reporter o di perturbazione per studiare l’accoppiamento segnale-gene nelle cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale Elk-1 (h2) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di ELK1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale Elk-1 (h2) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione ELK1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di Elk-1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo ELK1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.