Particules Lentivirales d'Activation (m) Dnmt1: sc-420033-LAC

Dnmt1 chez la souris code la DNA méthyltransférase 1 (DNMT1), la principale méthyltransférase de maintenance, qui recopie les profils de méthylation des CpG sur l’ADN néosynthétisé durant la phase S afin de préserver la mémoire épigénétique après la réplication. DNMT1 agit de concert avec UHRF1, PCNA et des facteurs associés à la chromatine pour coupler le maintien de la méthylation de l’ADN à la réplication de l’ADN, au remodelage de la chromatine, à la répression transcriptionnelle et à la stabilité du génome. En régulant la méthylation des promoteurs et des éléments répétitifs, DNMT1 influence l’engagement de lignée, l’empreinte génomique, l’inactivation du chromosome X et la suppression des éléments transposables. Une activité ou une expression dérégulée de DNMT1 est associée aux paysages de méthylation aberrants observés en oncologie, aux défauts du développement et aux modèles d’instabilité épigénétique, ce qui étaye son utilisation dans des études de régulation génique et de transitions d’état de la chromatine.

Les particules d'activation lentivirales Dnmt1 (m) répondent à ce besoin en encapsulant le système complet d'activation transcriptionnelle SAM (Synergistic Activation Mediator) dans des particules lentivirales à titre élevé prêtes à la transduction, permettant une régulation à la hausse efficace de Dnmt1 dans un plus large éventail de types de cellules humaines.

Les particules d'activation lentivirales Dnmt1 (m) délivrent tous les composants fonctionnels du système médiateur d'activation synergique (SAM) via la transduction lentivirale. Le système comprend trois préparations de particules co-transduites dans les cellules cibles : l'une codant pour une dCas9 catalytiquement inactive (mutations D10A et N863A) fusionnée au domaine de transactivation VP64 avec un gène de résistance à la blasticidine ; une codant pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1 avec un gène de résistance à l'hygromycine ; et une codant pour un ARNsg de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 avec un gène de résistance à la puromycine. Après transduction lentivirale et intégration génomique des cassettes d'expression, les composants du SAM sont exprimés de manière stable et s'assemblent au locus cible dans la région promotrice proximale en amont du site de départ de la transcription Dnmt1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de manière coopérative pour recruter l'appareil transcriptionnel endogène et induire une régulation à la hausse soutenue de l'expression endogène de Dnmt1. L'utilisation de dCas9 inactif sur les nucléases évite l'introduction de cassures double brin de l'ADN et préserve le locus génomique natif Dnmt1 ainsi que l'architecture régulatrice.

Le format lentiviral offre plusieurs avantages pratiques : l'intégration génomique stable permet une activation héréditaire au fil des divisions cellulaires ; les préparations de particules à titre élevé éliminent le besoin d'une production virale en interne ; et la compatibilité avec les types de cellules primaires, non divisibles et résistantes à la transfection élargit l'accessibilité expérimentale. Le succès de la transduction peut être confirmé et renforcé par une triple sélection antibiotique utilisant la puromycine, l'hygromycine et la blasticidine.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.