cytoglobin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402949-ACT

Humanes CYGB kodiert Cytoglobin, ein Protein der Globin-Familie, das Häm bindet und zur zellulären Sauerstoffhandhabung sowie zur Redox-Homöostase beiträgt. CYGB ist an der Regulation des Stickstoffmonoxid-Stoffwechsels beteiligt, begrenzt reaktive Sauerstoffspezies und unterstützt Überlebensprogramme bei Hypoxie und oxidativem Stress über Signalwege, die mit der HIF-Signalgebung und stressresponsiven transkriptionellen Netzwerken verknüpft sind. Eine Expression wurde in zahlreichen Geweben und Zelltypen beschrieben, mit kontextabhängigen Rollen bei der Aktivierung von Fibroblasten, in der Gefäßbiologie und bei der zellulären Anpassung an metabolischen Stress. Eine Fehlregulation der CYGB-Aktivität oder -Expression wurde mit entzündungs- und fibroseassoziierten Phänotypen in Verbindung gebracht und in onkologischen Kontexten untersucht, in denen Sauerstoff- und Redoxgleichgewicht Proliferation, Invasion und Mechanismen des Therapieansprechens beeinflussen.

cytoglobin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CYGB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

cytoglobin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CYGB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CYGB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen cytoglobin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CYGB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von cytoglobin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des cytoglobin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CYGB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.