CRSP70 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402381-ACT

MED26 kodiert CRSP70, eine zentrale Untereinheit des Mediator-Komplexes, der sequenzspezifische Transkriptionsfaktoren mit der RNA-Polymerase II verbindet und dazu beiträgt, die Transkriptionsinitiation mit der Elongation zu koordinieren. Durch die Einbindung des CDK8-Moduls und des Super-Elongation-Complexes (SEC) trägt MED26 zur Freisetzung der promotorproximalen Pause und zur dynamischen Regulation von Genexpressionsprogrammen bei, die an Zellidentität und Stressantworten beteiligt sind. Eine veränderte Mediator-Funktion, einschließlich der Fehlregulation von MED26-assoziierten Transkriptionsnetzwerken, ist relevant für Studien zu Entwicklungsstörungen und zur krebsassoziierten Umprogrammierung der Transkription. Als nukleärer Regulator der Pol-II-Transkription wird CRSP70 häufig in pathway-basierten Analysen der Enhancer-Promotor-Kommunikation, der chromatinabhängigen Genregulation und der kontextspezifischen Kopplung von Signalwegen an die Transkription untersucht.

CRSP70 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MED26-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CRSP70 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MED26-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MED26-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CRSP70-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MED26-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CRSP70-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CRSP70-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MED26-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.