CPOX Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405130-ACT

O CPOX humano codifica a coproporfirinogênio oxidase, uma enzima mitocondrial da via de biossíntese do heme que catalisa a conversão de coproporfirinogênio III em protoporfirinogênio IX. Ao sustentar a disponibilidade celular de heme, o CPOX influencia a respiração mitocondrial, a função dos citocromos, a homeostase redox e a detecção de oxigênio em tecidos metabolicamente ativos. A atividade desregulada de CPOX perturba o fluxo de porfirinas e pode alterar intermediários intracelulares de porfirina que afetam o estresse oxidativo e a sinalização metabólica. A disrupção genética e bioquímica desse ponto é relevante para distúrbios do metabolismo de porfirinas e para estudos mecanísticos de disfunção mitocondrial em modelos celulares e teciduais.

CPOX O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CPOX sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CPOX O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CPOX em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CPOX, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CPOX. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CPOX nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CPOX no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CPOX em células tumorais com expressão de CPOX silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.