COL8A2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403831-ACT

COL8A2 kodiert die Alpha-2-Kette von Kollagen Typ VIII, einem nicht fibrillären, kurzkettigen Kollagen, das zur Organisation der extrazellulären Matrix und zu basal­membranassoziierten Strukturen beiträgt. In okulären Geweben ist es besonders im Hornhautendothel und in der Descemet-Membran angereichert, wo es den Matrixaufbau, die Zelladhäsion und die biomechanische Integrität unterstützt. Das mit COL8A2 assoziierte Matrix-Remodeling steht in Wechselwirkung mit Signalwegen der Zell-Matrix-Kommunikation, darunter integrinvermittelte Adhäsion und der Umsatz der extrazellulären Matrix. Genetische Varianten oder eine fehlregulierte Expression von COL8A2 wurden mit kornealen Endotheldystrophien in Verbindung gebracht, was COL8A2 zu einem relevanten Ziel für die Untersuchung der Homöostase der extrazellulären Matrix und der Endothelzellfunktion macht.

COL8A2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen COL8A2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

COL8A2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des COL8A2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der COL8A2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen COL8A2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native COL8A2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von COL8A2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des COL8A2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem COL8A2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.