Plasmide CRISPR d'Activation (h) CCDC89: sc-408069-ACT

CCDC89 (coiled-coil domain containing 89) code une protéine prédite à domaine coiled-coil, impliquée dans l’organisation du cytosquelette et dans des réseaux d’interactions protéine–protéine qui soutiennent l’architecture intracellulaire et la signalisation. Les protéines à coiled-coil participent fréquemment à des fonctions d’échafaudage influençant le positionnement des organites, le trafic vésiculaire et les voies de réponse au stress, ce qui suggère que CCDC89 pourrait moduler la coordination spatiale des processus cellulaires. Des associations au niveau de l’expression et des variants, rapportées dans divers jeux de données de génomique, indiquent une pertinence potentielle de CCDC89 dans des programmes transcriptionnels dérégulés observés dans des contextes prolifératifs et neurobiologiques, ce qui motive des études mécanistiques dans des modèles cellulaires pertinents pour les maladies. Définir comment CCDC89 influence le câblage des voies de signalisation peut clarifier les effets en aval sur les transitions d’état cellulaire, les phénotypes d’adhérence/motilité et la protéostasie.

CCDC89 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CCDC89 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CCDC89 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CCDC89 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CCDC89, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CCDC89. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CCDC89 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CCDC89 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CCDC89 dans les cellules tumorales présentant une expression de CCDC89 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.