CapZ-α1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405348-ACT

CAPZA1 codifica CapZ-α1, una proteina di capping dell’estremità “barbed” dei filamenti di actina che, in associazione con subunità β, regola la dinamica della polimerizzazione dell’actina, la stabilità dei filamenti e il rimodellamento del citoscheletro. Controllando l’assemblaggio dell’actina al margine di avanzamento e nelle fibre di stress, CapZ-α1 influenza forma cellulare, adesione e motilità, integrandosi con le vie che governano il turnover delle adesioni focali e la meccanotrasduzione. L’attività di CAPZA1 è inoltre collegata all’organizzazione sarcomerica e contrattile dell’actina, a supporto di studi sull’architettura del citoscheletro in stati cellulari differenziati e proliferativi. Un capping e un rimodellamento dell’actina deregolati sono spesso implicati in fenotipi rilevanti per l’invasione oncogenica, l’integrità strutturale dei cardiomiociti e altri disturbi in cui alterazioni della meccanica citoscheletrica contribuiscono alla patologia.

CapZ-α1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CAPZA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CapZ-α1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CAPZA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CAPZA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CapZ-α1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CAPZA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CapZ-α1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CapZ-α1 nelle cellule tumorali con espressione di CAPZA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.