Plasmide CRISPR d'Activation (h) Cacna2d1: sc-402833-ACT

CACNA2D1 code la sous-unité auxiliaire α2δ1 des canaux calciques voltage‑dépendants, un régulateur clé du trafic des canaux, de leur localisation membranaire et des propriétés de gating qui déterminent l’entrée de Ca2+ lors de l’activité électrique. En modulant la signalisation dépendante du calcium, Cacna2d1 influence le couplage excitation–contraction, la libération de neurotransmetteurs et des voies en aval liées à la régulation transcriptionnelle et aux réponses cellulaires au stress. Une expression altérée de CACNA2D1 a été associée à une homéostasie calcique dérégulée dans des contextes cardiaques et neuromusculaires, et a été étudiée en lien avec des phénotypes arythmogènes, les circuits de signalisation de la douleur et l’excitabilité neuronale. En tant que composant d’un complexe de canaux à la surface cellulaire, elle constitue un point d’entrée accessible pour disséquer la signalisation calcique dépendante des stimuli et le comportement électrophysiologique à l’échelle des réseaux dans des systèmes modèles humains.

Cacna2d1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CACNA2D1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Cacna2d1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CACNA2D1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CACNA2D1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Cacna2d1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CACNA2D1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Cacna2d1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Cacna2d1 dans les cellules tumorales présentant une expression de CACNA2D1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.