Plasmide CRISPR d'Activation (h) BAP1: sc-400232-ACT

BAP1 (BRCA1 associated protein 1) code une déubiquitinase nucléaire qui agit comme suppresseur de tumeur et régulateur de la chromatine. En tant que cœur catalytique du complexe PR-DUB, BAP1 retire la monoubiquitine de l’histone H2A (H2AK119ub), modulant des programmes transcriptionnels dépendants de Polycomb et influençant les décisions de destinée cellulaire. BAP1 participe également aux réponses aux dommages de l’ADN, au contrôle du stress réplicatif et à la régulation de l’apoptose via des interactions avec les protéines ASXL et d’autres facteurs associés à la chromatine. Les altérations avec perte de fonction et la diminution de l’expression de BAP1 sont liées à une perturbation de l’homéostasie épigénétique et sont fréquemment étudiées dans le contexte de la biologie du mésothéliome, du mélanome uvéal et du carcinome à cellules rénales.

BAP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BAP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

BAP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BAP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BAP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de BAP1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BAP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de BAP1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie BAP1 dans les cellules tumorales présentant une expression de BAP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.