Arkadia CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403319-ACT

Humanes RNF111 kodiert Arkadia, eine RING-Typ-E3-Ubiquitin-Ligase, die die Signalübertragung der TGF-β-Superfamilie moduliert, indem sie regulatorische Komponenten ubiquitiniert und so Stärke und Dauer der SMAD-abhängigen Transkription formt. Über eine ubiquitinvermittelte Proteostase beeinflusst Arkadia nukleare Signalausgänge, die Zellschicksalsentscheidungen, Differenzierungsprogramme und eine kontextabhängige Wachstumskontrolle steuern. Die RNF111-Aktivität überschneidet sich mit Signalwegen, die die Transkriptionsregulation und den Proteinabbau kontrollieren, was sie für Studien der Entwicklungsbiologie und der zellulären Plastizität relevant macht. Eine fehlregulierte TGF-β/SMAD-Signalgebung und veränderte Dynamiken des Ubiquitin-Systems, die mit RNF111 in Verbindung stehen, wurden in mehreren Modellsystemen mit pathologischem Remodeling und tumorassoziierten Signalzuständen assoziiert.

Arkadia Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RNF111-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Arkadia Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RNF111-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RNF111-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Arkadia-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RNF111-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Arkadia-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Arkadia-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RNF111-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.