Plasmide CRISPR d'Activation (m) ARA70: sc-424185-ACT

La souris Ncoa4 code ARA70, un coactivateur des récepteurs nucléaires qui module les programmes transcriptionnels en faisant le lien entre les récepteurs activés par leur ligand, la chromatine et la machinerie basale de transcription. ARA70 influence l’expression de gènes sensibles aux hormones, notamment des voies associées à la signalisation du récepteur des androgènes ainsi qu’à des processus plus larges, dépendants des récepteurs nucléaires, de métabolisme et de différenciation. NCOA4 est également impliqué dans l’homéostasie du fer via des fonctions liées au renouvellement de la ferritine, reliant la régulation transcriptionnelle aux réponses cellulaires au stress. L’activité dérégulée de NCOA4/ARA70 a été étudiée dans des contextes d’altération de la signalisation endocrinienne, de contrôle de la prolifération et de phénotypes associés au métabolisme du fer, pertinents pour la biologie des maladies.

ARA70 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ncoa4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ARA70 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ncoa4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ncoa4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ARA70. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ncoa4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ARA70 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ARA70 dans les cellules tumorales présentant une expression de Ncoa4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.