Plasmide CRISPR d'Activation (h) Aminoacylase-1: sc-408464-ACT

ACY1 code l’aminoacylase-1, une hydrolase cytosolique dépendante du zinc qui catalyse la désacylation des N-acyl-L-acides aminés afin de produire des acides aminés libres et de l’acétate. Cette activité favorise la récupération des acides aminés et le métabolisme de l’azote, et peut moduler les réserves intracellulaires de substrats qui s’inscrivent dans des voies métaboliques plus larges ainsi que dans les réseaux de protéostasie. L’aminoacylase-1 est également impliquée dans la prise en charge de dérivés d’acides aminés acétylés issus du renouvellement des peptides, reliant ainsi sa fonction au maintien de l’homéostasie cellulaire en situation de stress métabolique. Des altérations de l’expression d’ACY1 ont été rapportées dans de multiples contextes pathologiques, notamment la reprogrammation métabolique associée au cancer et des erreurs innées du métabolisme touchant les acides aminés, ce qui en fait un nœud pertinent pour des études mécanistiques.

Aminoacylase-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ACY1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Aminoacylase-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ACY1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ACY1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Aminoacylase-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ACY1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Aminoacylase-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Aminoacylase-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ACY1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.