ALKBH8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407123-ACT

ALKBH8 codifica un’ossigenasi dipendente da 2-ossoglutarato/Fe(II) coinvolta nella modificazione dell’RNA, in particolare nella maturazione dell’uridina wobble (U34) in specifici tRNA attraverso passaggi di metilazione e successiva idrossilazione. Modulando l’efficienza di decodifica dei tRNA e la fedeltà della traduzione, ALKBH8 collega la regolazione epitranscrittomica dell’RNA al mantenimento del proteoma e alle risposte cellulari allo stress. Alterazioni dell’attività di ALKBH8 possono modificare programmi di traduzione dipendenti dal bias dei codoni e, in sistemi modello, sono state associate a fenotipi di proliferazione deregolata e di instabilità genomica. Queste caratteristiche rendono ALKBH8 rilevante per studi sul metabolismo dell’RNA, sull’adattamento allo stress ossidativo e sul rimodellamento della traduzione associato alle malattie.

ALKBH8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ALKBH8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ALKBH8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ALKBH8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ALKBH8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ALKBH8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ALKBH8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ALKBH8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ALKBH8 nelle cellule tumorali con espressione di ALKBH8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.