Plasmide CRISPR d'Activation (m) ALCAM: sc-419076-ACT

Alcam code la molécule d’adhésion des leucocytes activés (ALCAM/CD166), un récepteur de la superfamille des immunoglobulines qui médie des interactions homophiliques et hétérophiliques afin de réguler l’adhésion cellule–cellule, la migration et l’organisation des tissus au cours du développement de la souris et de l’homéostasie à l’âge adulte. ALCAM participe à des processus liés au remodelage du cytosquelette et à la dynamique des jonctions, influençant l’intégrité épithéliale, le guidage axonal et le trafic des cellules immunitaires. Via une signalisation dépendante de l’adhésion, ALCAM peut moduler des voies qui contrôlent la prolifération et la différenciation, avec des effets dépendants du contexte sur l’activité des voies MAPK et PI3K-AKT. Une expression dérégulée d’ALCAM a été associée à des propriétés de type « stem », ainsi qu’à l’invasion et au comportement métastatique dans de multiples modèles de maladie, ce qui en fait un nœud utile pour étudier la plasticité phénotypique induite par l’adhésion.

ALCAM Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Alcam sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ALCAM Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Alcam dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Alcam, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ALCAM. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Alcam natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ALCAM au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ALCAM dans les cellules tumorales présentant une expression de Alcam silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.