ACADVL (VLCAD) CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403111-ACT

ACADVL kodiert die Very-long-chain-Acyl-CoA-Dehydrogenase (VLCAD), ein mitochondriales Flavoprotein, das den ersten Dehydrierungsschritt in der β‑Oxidation langkettiger Fettsäure‑Acyl‑CoAs katalysiert. Die VLCAD-Aktivität unterstützt die zelluläre Energiehomöostase, indem sie den Fettsäureabbau über ETF/ETFDH an den Elektronentransfer und die nachgeschaltete oxidative Phosphorylierung koppelt, insbesondere in energieintensiven Geweben wie Herz- und Skelettmuskel. Eine veränderte ACADVL-Expression oder -Funktion stört die mitochondriale Fettsäureoxidation, begünstigt die Akkumulation langkettiger Acylcarnitine und beeinträchtigt die metabolische Flexibilität bei Fasten oder erhöhtem Energiebedarf. Daher wird ACADVL häufig im Kontext erblicher Störungen der Fettsäureoxidation sowie breiterer mitochondrialer Stoffwechselstörungen untersucht, die für kardiometabolische und myopathische Phänotypen relevant sind.

ACADVL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ACADVL-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ACADVL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ACADVL-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ACADVL-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ACADVL-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ACADVL-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ACADVL-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ACADVL-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ACADVL-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.