Plasmide CRISPR d'Activation (h) α_1A-AR: sc-401726-ACT

ADRA1A code le récepteur adrénergique alpha 1A humain (α1A-AR), un récepteur couplé aux protéines G qui se couple principalement à Gq/11 afin d’activer la phospholipase C, d’augmenter le Ca2+ intracellulaire et de stimuler une signalisation dépendante de la PKC. Les effets en aval comprennent la modulation de la contractilité du muscle lisse, de la sécrétion et de l’excitabilité neuronale via des voies dépendantes du calcium ainsi que la signalisation MAPK/ERK. Le récepteur α1A-AR participe à la régulation, médiée par les catécholamines, du tonus vasculaire et de la fonction du muscle lisse génito-urinaire, et sa signalisation s’inscrit à l’interface de réseaux adrénergiques plus larges impliqués dans la réponse au stress. Des modifications de l’expression des récepteurs adrénergiques ou de la dynamique de leurs voies de signalisation ont été associées à des phénotypes cardiovasculaires et neurophysiologiques, ce qui soutient des recherches sur les réponses transcriptionnelles et de seconds messagers dépendantes du récepteur.

α1A-AR Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ADRA1A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

α1A-AR Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ADRA1A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ADRA1A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de α1A-AR. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ADRA1A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de α1A-AR au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie α1A-AR dans les cellules tumorales présentant une expression de ADRA1A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.