Plasmide CRISPR d'Activation (h) α1a Tubulin: sc-400022-ACT

TUBA1A code l’α1a-tubuline humaine, un composant central des hétérodimères α/β-tubuline qui polymérisent en microtubules afin de soutenir l’architecture du cytosquelette, le transport intracellulaire et la formation du fuseau mitotique. La dynamique des microtubules portée par l’α1a-tubuline contribue à la polarité cellulaire, à la croissance axonale et à la migration neuronale, en s’intégrant aux voies qui contrôlent le remodelage du cytosquelette, la progression du cycle cellulaire et le trafic médié par les protéines motrices. Une fonction dérégulée de TUBA1A est associée à des phénotypes neurodéveloppementaux liés à une assemblage défectueux des microtubules et à une connectivité neuronale altérée, ce qui en fait un marqueur utile pour étudier l’intégrité du cytosquelette dans les systèmes neuronaux. En tant que protéine structurale largement exprimée, l’α1a-tubuline est fréquemment utilisée dans des essais visant à évaluer la stabilité des microtubules, le positionnement des organites et les modifications du cytosquelette associées à la différenciation.

α1a Tubulin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TUBA1A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

α1a Tubulin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TUBA1A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TUBA1A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de α1a Tubulin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TUBA1A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de α1a Tubulin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie α1a Tubulin dans les cellules tumorales présentant une expression de TUBA1A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.