V-ATPase α1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403882-ACT

ATP6V1A codifica a subunidade α1 da V-ATPase, um componente central do setor citosólico V1 que acopla a hidrólise de ATP à translocação de prótons pelo complexo H⁺-ATPase vacuolar. Essa enzima acidifica endossomos, lisossomos e vesículas secretórias, sustentando a endocitose mediada por receptor, o fluxo autofágico, o tráfego de membranas e o processamento de proteínas, além de contribuir para a homeostase do pH na membrana plasmática em contextos especializados. Ao controlar a acidificação de organelas, a atividade da V-ATPase influencia a detecção de nutrientes e programas de sinalização, incluindo vias ligadas à regulação de mTORC1 e à maturação de vesículas. A acidificação vacuolar desregulada e alterações na função de ATP6V1A têm sido associadas a fenótipos relevantes para a neurobiologia, a biologia de células cancerígenas e as interações hospedeiro–patógeno, tornando-a um alvo útil para estudos mecanísticos de proteostase e transporte intracelular.

V-ATPase α1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATP6V1A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

V-ATPase α1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATP6V1A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATP6V1A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de V-ATPase α1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATP6V1A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de V-ATPase α1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via V-ATPase α1 em células tumorais com expressão de ATP6V1A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.