TRF1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401433-ACT

TERF1 kodiert den telomerischen Repeat-bindenden Faktor 1 (TRF1), einen zentralen Bestandteil des Shelterin-Komplexes, der an doppelsträngige telomerische DNA bindet und die Homöostase der Telomerlänge reguliert. TRF1 koordiniert die Telomerreplikation und den Schutz der Chromosomenenden, indem es den Zugang der Telomerase moduliert und eine korrekte Fortschreitung der Replikationsgabel durch telomerische Repeats unterstützt, wodurch Telomerfragilität und aberrante DNA-Schadenssignalgebung begrenzt werden. Über seine Funktionen an Chromosomenenden ist TRF1 mit Signalwegen der Genomstabilität verknüpft, einschließlich ATM/ATR-vermittelter DNA-Schadensantworten und der mitotischen Chromosomensegregation. Eine dysregulierte TERF1/TRF1-Aktivität wurde mit Telomer-Dysfunktionsphänotypen in Zusammenhang gebracht, die für die Biologie des Alterns und die Krebsgenomik relevant sind, da eine veränderte Telomererhaltung zur chromosomalen Instabilität beiträgt.

TRF1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TERF1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TRF1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TERF1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TERF1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TRF1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TERF1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TRF1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TRF1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TERF1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.